Новый набор плазмид упростит генетическую модификацию метилотрофных дрожжей

Сотрудники ФИЦ Биотехнологии РАН (Москва) вместе с коллегами из Курчатовского института (Москва) предложили подход, который значительно упростит процесс редактирования генома при помощи системы CRISPR-Cas9 у метилотрофных дрожжей. За основу авторы взяли две искусственные плазмиды — кольцевые молекулы ДНК, — одна из которых несла ген, кодирующий белок Cas9, а вторая — короткую РНК, распознающую место в геноме, которое нужно «отредактировать». Кроме того, в последовательности включили бактериальные гены, обеспечивающие устойчивость к антибиотику генетицину. Эти гены служили своеобразным маркером, с помощью которого можно было точно выявить те дрожжевые клетки, в которых вставка плазмид произошла успешно. Так, если дрожжи оказывались способны расти на среде с антибиотиком, значит, в них также присутствовала система CRISPR-Cas9.

Исследователи одновременно ввели в клетки дрожжей две вышеописанные плазмиды, предварительно разрезав особым образом — так, чтобы они смогли «найти» друг друга в клетке и соединиться концевыми участками в единую последовательность. Образовавшаяся в результате единая плазмида поддерживалась в клетках дрожжей автономно, то есть без внедрения в хромосому. После того, как доставленная таким образом система CRISPR-Cas9 выполнила свою функцию по редактированию генов, плазмида удалялась. Авторы продемонстрировали эффективность предложенного подхода, успешно отредактировав геномы четырех видов метилотрофных дрожжей: Ogataea polymorpha, O. parapolymorpha, O. haglerorum и Komagataella phaffii.

«Потенциально наша система может использоваться для изменения одновременно нескольких генов, однако это нам еще предстоит проверить в новых экспериментах. Вместе с тем, уже сейчас у нас есть хороший инструмент для редактирования геномов метилотрофных дрожжей, что расширяет возможности их использования для создания штаммов-продуцентов рекомбинантных белков и применения к ним методов метаболической инженерии», — рассказывает один из авторов исследования, Михаил Агафонов, д.б.н., руководитель группы генной инженерии низших эукариот ФИЦ Биотехнологии РАН.